EI Eisuke Itakura ,CC Changchun Chen,MB Mario de Bono

第一次发布: 2017年08月05日第7卷第15期 DOI: 10.21769/BioProtoc.2430

评审: Jyotiska ChaudhuriLiang Liu 匿名评审

Abstract

本协议描述了一种从哺乳动物细胞中纯化带有二硫键的糖基化FLAG标签分泌蛋白的方法。纯化产物可用于各种应用，例如配体结合分析。

背景介绍

大肠杆菌是原核生物和真核生物重组蛋白生产的首选宿主之一。细菌表达系统的主要优点是高产量和低成本。然而，成熟蛋白对于功能分析（例如，配体结合分析）是必不可少的。大多数分泌的真核蛋白在细胞内质网中通过共价糖链连接和二硫键的形成进行后翻译修饰。这些共价修饰对于分泌成熟蛋白的总体稳定性和折叠是至关重要的。因此，生产哺乳动物分泌蛋白的最佳方法是使用哺乳动物宿主，以确保产生经过适当后翻译修饰的重组蛋白。在以下协议中，我们描述了从哺乳动物细胞纯化分泌蛋白的详细程序。此协议适用于生产FLAG标记蛋白，但应也适用于其他标记（例如，His标签）蛋白的纯化。

材料和试剂

移液器尖（VWR）
12孔板（Corning, Falcon®, 目录号：353043）
100 mm组织培养皿（Corning, Falcon®, 目录号：353803）
Amicon Ultra 15过滤单元 3K（EMD Millipore，目录号：UFC900308）
1.5 ml管（VWR，目录号：89000-028）
50 ml Falcon管（Corning, Falcon®, 目录号：352070）
1 ml注射器（Terumo Medical，目录号：SS-01T）
30 G针头（BD，目录号：305128）
Flp-In T-rex 293细胞系（Thermo Fisher Scientific, InvitrogenTM，目录号：R78007）（可选）
pcDNA5 FRT TO（Thermo Fisher Scientific, InvitrogenTM，目录号：V652020）（可选）
潮霉素B（NACALAI TESQUE，目录号：07296-11）（可选）
链霉素（Wako Pure Chemical Industries, 目录号：029-18701）（可选）
多西环素（Takara Bio, Clontech，目录号：631311）（可选）
Dulbecco’s改良Eagle培养基（DMEM）（Sigma-Aldrich，目录号：D6546）
胎牛血清（FBS）（Biosera，目录号：FB-1345/500）
抗Flag M2琼脂糖珠（Sigma-Aldrich，目录号：A2220）
青霉素-链霉素（Thermo Fisher Scientific, GibcoTM，目录号：15070063）
醋酸钾（KAc）（Sigma-Aldrich，目录号：236497）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
氯化镁（MgCl2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
3xFlag肽（Sigma-Aldrich，目录号：F4799）
磷酸盐缓冲液（PBS）
生长培养基（见配方）
洗涤缓冲液（见配方）
洗脱缓冲液（见配方）

配方

1. 生长培养基（560.5 ml）
   500 ml DMEM
   55 ml 10% FBS
   5.5 ml 1% 青霉素-链霉素
2. 洗涤缓冲液（50 ml）
   5.5 ml 1 M KAc（110 mM）
   1 ml 1 M HEPES（pH 7.4）（20 mM）
   100 μl 1 M MgCl2（2 mM）
   用Millipore水补至50 ml
3. 洗脱缓冲液（210 μl）
   10 μl 5 mg/ml 3xFlag肽（0.25 mg/ml）
   200 μl 1x PBS

设备

移液器（例如，Gilson）

37 °C，5% CO2培养箱（例如，Panasonic Biomedical，目录号：MCO-170AICUV-PE）

位于冷室的管旋转器（例如，Fisher Scientific，目录号：88-861-049）

离心机（例如，Eppendorf，型号：5804）

细胞培养显微镜（例如，Carl Zeiss，维也纳，奥地利）

步骤

A. 使用Flp-In T-rex 293细胞系生成稳定细胞株（图1）

注意：Flp-In T-rex 293细胞系适合用于您感兴趣的3xFLAG标记蛋白的诱导、稳定和均匀高表达。只要转染效率（通过免疫荧光确定）超过50%，临时转染的细胞系也可以使用。

[^图1. 如何准备稳定Flp-in T-rex 293细胞株的流程图。]: 将Flp-in T-rex 293细胞与质粒（pcDNA5 FRT TO带有感兴趣基因的质粒和pOG44，它包含一个用于flippase的基因）共转染。第二天，用潮霉素B培养细胞，以选择在基因组区域FRT位点整合了感兴趣基因的细胞。多克隆稳定细胞株是均匀表达的。

1. 在每个12孔板的孔中播种1 × 10^5个Flp-In T-rex 293细胞。
2. 当细胞达到约50%的融合度时，过夜培养，然后用含有FLAG标记的感兴趣基因的pcDNA5 FRT TO质粒和pOG44质粒转染Flp-In T-rex 293细胞。
3. 转染4-5天后，用100 μg/ml的潮霉素B和15 μg/ml的链霉素处理细胞，大约持续2周。

B. FLAG标记蛋白的纯化

1. 在含有10 μg/ml多西环素的生长培养基（见配方）中培养5个100 mm培养皿的Flp-In T-rex 293细胞，直到细胞大约达到80%的融合度，表达带有3xFLAG标记的蛋白质，培养1天。
2. 将细胞培养基更换为含有多西环素的10 ml DMEM培养基，并继续培养2天。
   注意：10% FBS培养基可能在浓缩步骤中堵塞Amicon离心过滤器。
3. 从所有五个100 mm培养皿中收集表达细胞培养基（条件培养基）到50 ml Falcon管中。
4. 在4 °C下以2,000 x g的转速离心5分钟。
5. 将上清液转移到Amicon离心过滤单元中。以4,000 x g的转速离心30-40分钟。
6. 重复步骤B5，直到保留体积小于2 ml。
7. 将浓缩的条件培养基转移到两个1.5 ml管中（每个管1 ml）。
8. 向每个管中加入100 μl预先用洗涤缓冲液（见配方）洗涤的50% FLAG M2珠子悬浮液。
9. 在4 °C下旋转孵育至少2小时。
10. 用100 x g离心1分钟洗涤珠子4次，最后一次洗涤后，尽可能去除缓冲液，同时尽量不破坏珠子，使用注射器针头。
11. 将珠子与0.2 ml室温下的洗脱缓冲液（见配方）孵育1小时，并在离心后收集纯化的FLAG标记蛋白。

References

1. Chen, C., Itakura, E., Nelson, G. M., Sheng, M., Laurent, P., Fenk, L. A., Butcher, R. A., Hegde, R. S. and de Bono, M. (2017). IL-17 is a neuromodulator of Caenorhabditis elegans sensory responses. Nature 542(7639): 43-48.