PL Paul LabedanCM Cédric MatthewsLK Laurent KodjabachianHC Harold CremerFT Fadel TissirCB Camille Boutin

第一次发布: 2016年03月20日第6卷第6期 DOI: 10.21769/BioProtoc.1757

评审: Pamela MaherOneil G. Bhalala 匿名评审

Abstract

在发育中和成熟的中央神经系统（CNS）中，室管膜分别衬覆着神经上皮和室管膜。这些室管膜上皮在脑的发育、形态发生和生理学方面发挥着重要作用。在成熟的CNS中，室管膜构成了脑实质和脑脊液（CSF）之间的屏障。室管膜细胞顶面最显著的特征是存在向室管膜腔延伸的多根运动纤毛。纤毛的摆动确保了CSF的循环，其功能受损会导致脑积水。为了有效的CSF流动，纤毛的摆动必须在单个细胞层面和组织层面上进行协调。这种协调是通过精确组织室管膜内纤毛定位来实现的。关于室管膜细胞中纤毛的平面组织，已经描述了两个主要特征（Mirzadeh等人，2010年），并且这两个特征都具有细胞和组织层面的意义（Boutin等人，2014年）。第一个特征，旋转极性，指的是纤毛摆动的方向。在细胞层面，所有纤毛向同一方向摆动（图1B，黑色箭头）。在组织层面，每个室管膜细胞将其摆动方向与邻近细胞协调一致（图1C，灰色箭头）。第二个特征，平移极性，是室管膜细胞独有的，指的是纤毛在丛中的聚集。在细胞层面，这个纤毛丛相对于室管膜细胞的中心位置发生偏移（图1B，红色箭头）。在组织层面，相邻细胞之间纤毛丛的位置协调一致（图1C）。在任一层面改变这些极性都会损害CSF的循环（Mirzadeh等人，2010年；Boutin等人，2014年；Guirao等人，2010年；Hirota等人，2010年；Ohata等人，2014年）。纤毛轴丝起源于基体（BB），这是垂直锚定在细胞亚顶端表面的圆柱形结构（图1D）。基体通过存在诸如基足或条纹根须等附属物而极化。基足向与纤毛摆动方向相关的方向突出，而条纹根须向纤毛摆动的相反方向突出（Marshall，2008年）。从BBs的“正视观察”组织允许可视化室管膜的极性（Mirzadeh等人，2010年；Boutin等人，2014年）。在这里，研究人员描述了一种用于观察小鼠脑室侧壁全装片（LWWM）中纤毛细胞的免疫荧光（IF）协议。此协议适用于经典的共焦显微镜分析。此外，如果需要观察特征小于光学衍射极限的结构，它也适用于超分辨率STimulated Emission Depletion（STED）显微镜。最后，研究人员描述了一种抗体组合，允许在单个样本中同时观察单个纤毛、单个细胞和组织层面的室管膜极性。

材料和方法

1. 显微镜载玻片 盖玻片

2. 特定发育阶段的小鼠 [出生后第1天（P1）至21天（P21）之间]

3. 1x PBS

4. Triton X-100

5. 4% 多聚甲醛（PFA）（以1x PBS稀释粉末制备）

6. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A-8022）

7. Hoechst 33258 溶液（Sigma-Aldrich，目录号：94403）

8. Mowiol（Merck Millipore Corporation，Calbiochem®，目录号：475904）

9. Prolong Gold 抗衰减剂（Thermo Fisher Scientific，Molecular ProbeTM，目录号：P36934）

10. ZO1（Thermo Fisher Scientific，InvitrogenTM，目录号：61-7300）

11. γ-tubulin [GTU-88]（Abcam，目录号：ab11316）

12. FGFR1OP（FOP）（Abnova Corporation，目录号：H00011116-M01）

13. β-连环蛋白（BD，目录号：610153）

14. FoxJ1（eBioscience，目录号：14-9965）

15. 乙酰化-α-tubulin（Sigma-Aldrich，目录号：T6793）

16. 二级抗体 抗兔 A647（Invitrogen，目录号：A21244）

    抗小鼠IgG1 A568（Invitrogen，目录号：A21124）

    抗小鼠IgG2b A488（Invitrogen，目录号：A21141）

    抗小鼠IgG1 A488（Invitrogen，目录号：A21121）

    抗小鼠IgG2b A568（Invitrogen，目录号：A21144）

    一级和次级抗体（见配方）

设备

1. 解剖工具包括镊子（Zillow，Dumont，型号：55）和超细微刀（Fine Science Tools，目录号：10316-14）
2. 共聚焦显微镜（OLYMPUS，型号：Fluoview FV1000）
3. 装备有100×油物镜（HC-PL-APO; NA 1.40; STED白）和592nm耗尽激光器的STED显微镜（Leica Microsystems，型号：SP8 3x STED）

步骤

此处描述的一般程序适用于对P1至P21小鼠的侧壁全装片中的室管膜细胞进行染色。然而，对于大于P5的小鼠，在染色前需执行组织解剖的最后一步，而对于小于P5的小鼠，则在染色后执行此步骤，以确保获得最佳结果。

1. 在颈椎脱臼后，从小鼠中取出大脑。
2. 在室温下用1x PBS对大脑进行解剖，以显露室管膜侧壁（图2）[Mirzadeh等人（2010）提供了一个包含视频的协议]。
3. 将整个装片固定在500 μl新鲜配制的4% PFA-0.1% Triton X-100溶液中，室温下浸泡12分钟。
4. 在室温下用1x PBS-0.1% Triton X-100（1 ml）洗涤三次，每次10分钟，并振荡。
5. 通过将侧壁与下方的纹状体分离来进行亚解剖[参见Mirzadeh等人（2010）对此步骤的精确描述]。
6. 在此步骤中进行亚解剖有助于对大于P5的组织进行染色。
7. 在含有1x PBS-3% BSA（1 ml）的封闭溶液中室温下振荡孵育1小时。
8. 在含有1x PBS-3% BSA（250-500 μl）的一级抗体中室温下振荡过夜。
9. 在室温下用1x PBS-0.1% Triton X-100（1 ml）洗涤三次，每次10分钟，并振荡。
10. 用1:800稀释的次级抗体和Hoechst（1:1,000）在1x PBS中稀释，对样本进行共聚焦观察，或者在仅用1x PBS稀释的次级抗体中进行STED观察（800 μl），在室温下振荡孵育1小时。
11. 在室温下用1x PBS-0.1% Triton X-100（1 ml）洗涤三次，每次10分钟，并振荡。
12. 对于小于P5的组织：在1x PBS中通过将侧壁与纹状体分离来进行亚解剖[参见Mirzadeh等人（2010）]。
13. 将整个装片放在载玻片上，使室管膜面朝上。
14. 直接在装片上加入7-8滴Mowiol（用于共聚焦观察样本）或Prolong封片介质（用于STED观察样本）。
15. 在样本上放置盖玻片。
16. 在成像前，将载玻片保持在室温下，避免光照，至少24小时。

图1. 室管膜细胞在侧壁的平面组织结构。A. 鼠前脑的示意图，显示了侧脑室侧壁的位置。虚线方框突出显示了用于分析室管膜平面极性的感兴趣区域。B-C. 示意图表示了感兴趣区域内室管膜细胞的平面组织结构。B. 在细胞层面上，室管膜纤毛聚集在丛中（虚红线），其定位偏离顶面中心（红箭头）。纤毛摆动（小黑箭头）是协调的。个体纤毛摆动的总和生成了丛摆动方向（厚灰箭头）。在单个细胞中，丛定位的方向与丛摆动的方向相关（C）。在组织层面上，摆动方向（灰箭头）和纤毛丛的定位（红箭头）在相邻室管膜细胞之间是协调的。D-E. 室管膜细胞个体（D）侧视图和“正视图”（E）的示意图。D. 多根纤毛轴丝（绿色）起源于垂直锚定在细胞顶面上的基体（BBs）（绿色）。BBs显示出极化的附属物，如基足（红点），这指示了纤毛的有效摆动方向（小黑箭头）。E. 从顶视图观察纤毛BBs揭示了所有室管膜极性特征。

图2. LWWM制备的解剖步骤。LWWM制备允许进行“正视”观察室管膜细胞。A. 从小鼠颅骨中取出的大脑。B. 使用显微解剖刀在两个半球之间（虚红线）切开大脑。C. 移除小脑（虚红线）。D-F. 使用显微解剖刀暴露海马（虚红线）。G-H. 将显微解剖刀插入脑室（箭头）以移除海马和内侧脑室壁。I. 沿虚红线移除皮质壁。J. 准备固定的整个装片，侧壁由虚红线勾勒。

图3. P1、P4、P5和P21 LWWM的共聚焦（A-E）和STED（F）图像染色的示例。LWWM染色的A. ZO1（绿色）和乙酰化-α-微管蛋白（红色）在P1。B. FoxJ1（绿色）和DAPI（蓝色）在P4。C. β-连环蛋白（绿色）和乙酰化-α-微管蛋白（红色）在P21。D. β-连环蛋白（绿色）和γ-微管蛋白（红色）在P21。E-F. FGFR1癌基因伴侣（FOP）在P5。比例尺：A-B中的10微米，C-D中的15微米，E-F中的2.5微米。

图4. 侧壁室管膜细胞平面组织分析（A、B、C）。在P21 LWWM上进行ZO1（白色）、FGFR1癌基因伙伴（FOP，绿色）和γ-微管蛋白（红色）的三重免疫染色，允许在单个样本中观察细胞和组织层面的旋转和平移极性。A. 显示组织组织的较大视野图片。B. 放大图，显示（A）中标记*的细胞。C. 放大图，显示（B）中显示的BBs斑点。使用Biotool1软件分析ZO1/FOP/γ-微管蛋白三重染色[如Boutin等人（2014）所述]，可以在基底体（BB）、细胞和组织层面定义极性参数。C’. 个体纤毛极性的定义：每个黑色向量代表个体BB的旋转极性轴，定义为从FOP（绿色）到γ-微管蛋白（红色）阳性点的方向。Biotool软件计算斑块中BB的平均方向，以定义与单个细胞摆动方向相对应的细胞旋转极性轴（灰色箭头）。B’-B”。在细胞层面的极性轴定义：细胞轮廓（绿色）和BB斑点（红色）。（B’）中的灰色向量代表细胞旋转极性轴，定义如C’所示。B’’中的红色箭头代表细胞平移极性轴，定义为从细胞中心（绿色十字）到BB斑点中心（红色十字）的方向。A’-A”。组织层面极性的分析：旋转和平移极性轴为每个细胞定义，并与字段的平均方向（黑色和红色粗箭头）进行比较。比例尺：A中的15微米，B中的2.5微米，C中的1微米。

新鲜制备的4% PFA溶液可以在-20 °C下保存最多一年，并在固定前融化。 短固定时间是确保良好染色的必要条件。12分钟的固定时间足以固定大和小组织，同时保留结构并给出最佳结果。研究人员建议不要超过20分钟进行室管膜观察。

Table 1. List of primary and secondary antibodies

References

1. Boutin, C., Labedan, P., Dimidschstein, J., Richard, F., Cremer, H., Andre, P., Yang, Y., Montcouquiol, M., Goffinet, A. M. and Tissir, F. (2014). A dual role for planar cell polarity genes in ciliated cells. Proc Natl Acad Sci U S A 111(30): E3129-3138.
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