KO Keisuke Okita

第一次发布: 2013年09月20日第3卷第18期 DOI: 10.21769/BioProtoc.907

Abstract

诱导多能干细胞（iPS细胞）的生成提供了一个使用患者特异性体细胞的机会，这些细胞是疾病建模和药物发现的重要资源。为了促进这些研究，从易于获取且侵入性较小的组织（如血液）中制备iPS细胞非常重要。在这里，我们描述了从成人外周血生成人iPS细胞的基本方法。在分离单核细胞之后，一组细胞因子的组合刺激了造血干细胞/祖细胞群体的扩张，这是本协议的主要目标。细胞被转导了编码重编程因子的质粒混合物。在大多数情况下，质粒在建立iPS克隆的过程中丢失。

---

材料和试剂

• 新鲜抗凝血（约10毫升）
• 无钙镁PBS（Nacalai tesque，目录号：14249-95）
• Ficoll-paque Plus（GE Healthcare，目录号：17-1440-02）
• StemSpan H3000（STEMCELL Technologies，目录号：0 9800）
• 重组人白细胞介素-6（100 μg/ml）（PeproTech，目录号：AF-200-06）
• 重组人干细胞因子（SCF）（300 μg/ml）（PeproTech，目录号：AF-300-07）
• 重组人血小板生成素（TPO）（300 μg/ml）（PeproTech，目录号：AF-300-18）
• 重组人Flt3配体（300 μg/ml）（PeproTech，目录号：AF-300-19）
• 重组人白细胞介素-3（10 μg/ml）（PeproTech，目录号：AF-200-03）
• 重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（10 μg/ml）（Wako，目录号：064-04541）
• Amaxa人类CD34+细胞核转染试剂盒（Lonza，目录号：VPA-1003）
• MEF饲养层（Repro Cell，目录号：RCHEFC003）
• Matrigel生长因子减少（BD Biosciences，目录号：356231）
• 灵长类ES细胞培养基（Repro Cell，目录号：RCHEMD001）
• Essential 6（Life Technologies，目录号：A1516401）
• 明胶（Sigma-Aldrich，目录号：G1890）
• Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）高糖含稳定L-谷氨酰胺（Nacalai tesque，目录号：08459-35）
• 胎牛血清（FBS）（Life Technologies，目录号：10437-028）
• 质粒套装2（Life Technologies，目录号：A15960）
• 血液培养基（见配方）
• 质粒混合物（见配方）
• 转染混合物（见配方）
• iPS培养基1（见配方）
• iPS培养基2（见配方）
• 0.1%明胶溶液（见配方）
• MEF培养基（见配方）

---

设备

• Nucleofector 2b（Lonza，目录号：AAB-1001）
• 6孔组织培养板（BD Biosciences，Falcon®，目录号：353046）
• 15毫升锥形管（BD Biosciences，Falcon®，目录号：352196）
• 50毫升锥形管（BD Biosciences，Falcon®，目录号：352070）
• 37 °C 5% CO2细胞培养箱
• 显微镜
• 离心机

---

实验步骤：

第0天
培养基准备：
向6孔板的一个孔中加入含有细胞因子的2毫升血液培养基。
在板的其他孔中加入2毫升PBS，以防止培养基过度蒸发，并将板存放在37°C、5% CO2的环境中。
单核细胞纯化：
将10毫升抗凝血（EDTA）中加入10毫升PBS。
在两个15毫升管中，分别加入5毫升Ficoll-Paque，然后轻轻加入10毫升血+PBS。
在18°C下以400 x g离心30分钟，使用慢加速和慢刹车。
小心移除上清液（约2毫升）的上层部分，不要破坏界面处的单核细胞。
将界面处的细胞（1-2毫升）转移到一个15毫升管中，与12毫升PBS混合均匀。
在18°C下以200 x g离心10分钟（使用慢刹车）。
用3毫升H3000培养基重悬细胞，并计数细胞。
准备3 x 106细胞的1.5毫升管分装。
在18°C下以200 x g离心10分钟（使用慢刹车）。
弃去上清液。
铺板：
将细胞悬浮在步骤1中制备的培养基中。
将板存放在37°C、5% CO2的环境中，约6天。此培养期间不需要更换培养基。
第5天
明胶涂层：
向6孔板每个孔中加入1毫升0.1%明胶溶液。
在37°C下孵育至少半小时。
MEF饲养层细胞准备：
在37°C下解冻MEF饲养层细胞，并计数细胞数量。
弃去上述准备中多余的明胶溶液。
在MEF培养基中将MEF饲养层细胞以每孔3 x 105细胞播种。
第6天
培养基准备：
从MEF饲养层细胞中吸出培养基。
向板中每个孔中加入2毫升含有细胞因子的血液培养基。
收获培养细胞：
将细胞悬浮在培养基中并计数细胞。活细胞数量通常约为1 x 106。
将悬浮细胞收集到15毫升管中。
在18°C下以200 x g离心10分钟（使用慢刹车）。在离心过程中，准备转染混合物。
核转染：
用手持移液器完全吸出细胞的上清液。
加入转染混合物并悬浮细胞，小心不要产生气泡。
使用程序U-008进行核转染。
铺板，每孔105至104细胞：
在核转染后立即向电穿孔杯中加入800微升H3000，收获细胞。核转染溶液中的金属离子对细胞有毒！
将细胞铺到MEF饲养层板上，每孔从5 x 105细胞到5 x 104细胞不等。
第8、10和12天
每孔添加额外的1.5毫升iPS培养基1。不要吸出现有的培养基。
第14天及以后
用1.5毫升iPS培养基1替换培养基。* 培养基更换每2天进行一次。
第25至35天
挑选直径约2毫米的克隆。

---

Notes：

可以使用冷冻的外周血单个核细胞（PBMC）与此协议配合使用。在第0天，直接在血液培养基中培养解冻的PBMC。
iPS细胞可以在无饲养层条件下建立，但效率较低。对于无饲养层条件，使用Matrigel涂层的板和iPS培养基2代替MEF饲养层和iPS培养基1。以下是制作Matrigel涂层板的步骤：
在4°C下解冻Matrigel，并将其稀释至在6毫升冷却的DMEM中相当于2毫克蛋白质的浓度。
将1毫升/孔的溶液添加到6孔板中。
在室温下储存1小时。
在播种细胞之前，用PBS清洗板一次。

---

配方
血液培养基
StemSpan H3000，包含以下细胞因子：

• 10 ng/ml IL-3
• 100 ng/ml IL-6
• 300 ng/ml SCF
• 300 ng/ml TPO
• 300 ng/ml Flt3配体
• 使用后立即使用
  质粒混合物（Addgene，http://www.addgene.org/Shinya_Yamanaka）
  使用以下质粒混合物。Set 1显示出更高的效率。在Set 2中，我们省略了WPRE序列，并用针对p53的shRNA替换了小鼠p53的显性负形式，该显性负形式存在于Set 1中。存放在-20°C。Set 2可以从Life Technologies购买。

**转染混合物** Amaxa CD34溶液 81.8 μl 补充剂 18.2 μl 质粒混合物（Set 1或2） 3 μl（3 μg） 使用后立即使用 **iPS培养基1** 灵长类ES细胞培养基，含4 ng/ml bFGF 存放在4°C，暗处一周 **iPS培养基2** Essential 6，含100 ng/ml bFGF 存放在4°C，暗处一周 **0.1%（w/v）明胶溶液** 将1克明胶粉末溶解在100毫升去离子水中（1% w/v，10倍浓度），高压灭菌后存放在4°C。 为了制备0.1%（1x）明胶溶液，将10倍明胶储备液在37°C下加热，然后将其中的50毫升加入到450毫升去离子水中。使用瓶盖过滤器（0.22 μm）过滤溶液，并存放在4°C。 **MEF培养基** 含10% FBS的DMEM 请注意，这里的专业术语已经尽量翻译成对应的中文，但对于某些特定产品名称和型号，保留了原英文名称以确保准确性。

---

References

1. Mack, A. A., Kroboth, S., Rajesh, D. and Wang, W. B. (2011). Generation of induced pluripotent stem cells from CD34+ cells across blood drawn from multiple donors with non-integrating episomal vectors. PLoS One 6(11): e27956.
2. Okita, K., Matsumura, Y., Sato, Y., Okada, A., Morizane, A., Okamoto, S., Hong, H., Nakagawa, M., Tanabe, K., Tezuka, K., Shibata, T., Kunisada, T., Takahashi, M., Takahashi, J., Saji, H. and Yamanaka, S. (2011). A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods 8(5): 409-412.
3. Okita, K., Yamakawa, T., Matsumura, Y., Sato, Y., Amano, N., Watanabe, A., Goshima, N. and Yamanaka, S. (2013). An efficient nonviral method to generate integration‐free human‐induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells 31(3): 458-466.