AB Audrey Le Bas *，HM Halina Mikolajek *，JH Jiandong Huo *，CN Chelsea Norman，JD Joshua Dormon，JN James H. Naismith ，RO Raymond J. Owens ，

第一次发布: 2022年05月05日第12卷第9期 DOI: 10.21769/BioProtoc.4406

评审: Joana Alexandra Costa ReisLuke A YatesSneha Ray

Abstract

SARS-CoV-2的刺突蛋白的受体结合域（RBD）与上皮细胞表面的血管紧张素转换酶-2（ACE-2）结合，导致融合，病毒进入细胞。这种相互作用可以通过羊驼衍生的纳米体（VHHs）与RBD的结合而被阻断，从而导致病毒中和。通过X射线晶体学对VHH-RBD复合物进行结构分析，可以精确地映射VHH表位，并解释和预测变异突变的影响。关键在于一种可重复生产并结晶化VHH-RBD复合物的协议。根据我们的经验，我们描述了一个表达和纯化蛋白的工作流程，以及生成VHH-RBD复合物衍射质量晶体的筛选条件。从构建载体到收获并冻结晶体以收集数据，生产和结晶化蛋白复合物大约需要十二天的时间。

Background

骆驼科动物（包括羊驼、驼羊和骆驼）产生一种独特的仅含重链的抗体，由可变域（VHH）与Fc恒定域（CH2和CH3）连接而成。VHHs可以作为单一域抗原结合蛋白或纳米体（Muyldermans, 2013）产生，在生命科学领域有广泛的应用（Pleiner等人，2015；Jovcevska和Muyldermans，2020）。针对COVID-19大流行（Dhama等人，2020），我们和其他许多研究团队开发了VHH试剂，这些试剂与SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合域（RBD）结合，并阻断了与细胞表面的ACE-2的结合，这是导致细胞感染的主要相互作用（Xiang等人，2020；Hanke等人，2020；Schoof等人，2020；Koenig等人，2021；Huo等人，2020，2021）。这些VHH的多聚体版本，无论是作为三聚体还是IgG Fc融合蛋白，都已证明可以在体外和COVID-19动物模型中中和SARS-CoV-2（Huo等人，2021；Nambulli等人，2021）。VHH-RBD复合物的结构分析揭示了两个表位聚集的区域，一个在或靠近ACE-2结合表面（簇2），另一个在RBD的对面（簇1）（Tang等人，2021）。关于VHH结合位点的信息使得可以解释和预测刺突蛋白中的突变效应。根据我们的经验，为了结晶某些VHH-RBD复合物，形成与两个VHH结合的正交位点的RBD复合物是必要的（Huo等人，2021）。

VHHs通常在E. coli菌株WK6中作为六组氨酸标记蛋白生产，使用异丙基硫代-β-D-1-半乳糖苷（ITPG）诱导性启动子，并添加分泌信号（例如，pelB或ompA），以便在诱导表达后从周质中回收VHH。初步纯化使用固定金属亲和色谱（IMAC），并添加凝胶过滤作为抛光步骤。另外，VHHs也可以直接从裂解细胞中纯化，不过根据我们的经验，通过渗透休克从周质提取可以获得更高的蛋白产量。

作为糖基化蛋白，SARS-CoV-2刺突蛋白的RBD生产需要在高级真核细胞中表达，为此已使用昆虫和哺乳动物细胞。在N端添加适当的信号序列以将产物定向到细胞培养基，并在C端添加六组氨酸标签以通过IMAC纯化。RBD的N-糖基化（Asn331和Asn343）引入了化学异质性，特别是在哺乳动物细胞中生产时，这通常会抑制结晶（Chang等人，2007）。通过在mannosidase抑制剂kifunensine的存在下培养细胞，N-糖基化可以被阻止在高甘露糖状态（GlcNAc2Man9糖型）。然后可以通过用endoglycosidase F1或H处理，将这些糖型修剪回单个N-乙酰葡萄糖胺残基（Chang等人，2007）。根据以往的经验（Nettleship等人，2013），这在进行VHH-RBD复合物纯化之前最有效地进行。

分泌的糖蛋白从细胞培养液中通过IMAC纯化时，一个问题是某些培养液成分在色谱步骤中取代了感兴趣的His标签蛋白，显著降低了产量。在这里，我们使用了一种自动化的亲和纯化方法，包括IMAC和凝胶过滤，该方法涉及分批将样本加载到Ni-NTA柱上，并在每批之间进行柱洗涤步骤（Nettleship等人，2009）。

我们已报道了使用商业筛选试剂盒、96孔格式和1-200纳升低样本量结晶化的多个VHH-RBD复合物。使用同步辐射X射线从主要的晶体命中收集衍射数据，并通过分子替换法解决了结构（Huo等人，2020，2021）。获得高质量晶体的关键在于蛋白质的制备。因此，在这篇文章中，我们描述了我们优化的工作流程，用于生产VHH-RBD复合物及其通过X射线晶体学分析的结晶化。

材料与试剂

A. 受体结合域（RBD）的生产

1. 载体构建

   a. 用KpnI/PmeI消化pOPINTTG载体（图1A）
   b. 人类密码子优化的合成RBD基因（编码氨基酸330-352），带有与pOPINTTG融合入口位点重叠的15个碱基扩展（小写字母）：
   5’gcgtagctgaaaccggcCCGAATATCACAAATCTTTGTCCTTTCGGAGAAGTATTCAACGCAACTCGCTTCGCATCAGTATATGCCTGGAACCGCAAACGAATTTCTAATTGTGTCGCCGACTACTCTGTGCTTTACAACTCAGCATCATTTTCAACATTCAAATGCTATGGTGTCTCCCCTACGAAGTTGAACGATCTTTGTTTCACTAATGTCTACGCCGATTCCTTTGTTATTAGGGGGGACGAGGTTCGCCAGATCGCGCCGGGCCAAACGGGCAAGATAGCTGACTATAATTATAAGCTGCCAGACGACTTTACAGGCTGCGTTATCGCTTGGAATTCAAACAATCTTGATAGCAAAGTGGGTGGTAATTATAACTACCTCTACAGACTGTTTCGCAAGTCTAATCTGAAGCCTTTCGAGCGGGACATCTCTACTGAGATCTATCAAGCTGGTTCAACCCCCTGCAATGGCGTCGAGGGTTTTAACTGTTACTTCCCACTTCAGTCATACGGATTTCAACCAACTAATGGGGTTGGCTATCAGCCGTACCGCGTGGTCGTTCTTAGCTTTGAGCTGCTTCACGCCCCTGCAACGGTGTGCGGACCGAAAAAAAGTACAAAaaacatcaccatcac 3’
   c. ClonExpress II一步克隆试剂盒（Vazyme，目录号：C113-02）
   d. NucleoSpin 148® 凝胶和PCR清洁试剂盒（MACHEREY-NAGEL，目录号：12303368）
   e. Stellar感受态细胞（Takara Bio，目录号：636766）
   f. LB培养基（Sigma-Aldrich，目录号：L3022）
   g. S.O.C.（超级优化肉汤与分解代谢抑制）恢复培养基（ThermoFisher Scientific，目录号：15544034）
   h. 阿莫西林（Sigma-Aldrich，目录号：A9393）
   i. 加入100 μg/mL阿莫西林的LB-琼脂平板
   j. 质粒小量提取试剂盒（例如，Qiagen，目录号：27104）
   k. Plasmid Plus Midi试剂盒（例如，Qiagen，目录号：12941）
   l. 测序引物：pTTfwd 5’ TCCACAGGTGTCCACTCC 3’
   pTTrev 5’ TCCTTTATTAGCCAGAGG 3’

2. 在expi293TM细胞中的表达

   a. 500 mL带挡板的无菌烧瓶，带通风盖（ThermoFisher Scientific，目录号：4116-0500）
   b. CountessTM细胞计数室滑片（ThermoFisher Scientific，目录号：C10228）
   c. Expi293TM细胞（ThermoFisher Scientific，目录号：A14527）
   d. Expi293TM表达培养基（ThermoFisher Scientific，目录号：A1435101）
   e. 台盼蓝溶液（ThermoFisher Scientific，目录号：15250061）
   f. 汉克平衡盐溶液（HBSS）（10×）（ThermoFisher Scientific，目录号：14185052）
   g. Gibco OPTI-MEM减血清培养基（ThermoFisher Scientific，目录号：31985062）
   h. 瓦罗酸（Sigma-Aldrich，目录号：P4543）
   i. 葡萄糖（45%溶液）（见配方或从Sigma-Aldrich，目录号：G8769）
   j. 丙酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：P1880）
   k. PEI MAX 40 K（Polysciences Inc.，目录号：24,765-1）
   l. Kifunensine（Sigma-Aldrich，目录号：K1140）
   m. 预制SDS聚丙烯酰胺凝胶（例如，NuPAGETM 10%，Bis-Tris，ThermoFisher Scientific，目录号：WG1201A）
   n. InstantBlue® Coomassie蛋白染色剂（Abcam，目录号：ab119211）

3. RBD纯化

​ a. 5 ml HisTrap_FF Ni-NTA柱（Cytiva，目录号：1752860）

​ b. SD75 16/600排阻色谱柱（Cytiva，目录号：28989333）

​ c. 丙咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I2399）

​ d. PBS，磷酸盐缓冲液，10×溶液（Fisher，目录号：BP399-20）

​ e. 洗涤缓冲液（见配方）

​ f. 洗脱缓冲液（见配方）

​ g. 凝胶过滤缓冲液（见配方）

B. VHH production

1. 载体构建

   a. 用SfiI切割的pADL-23c载体（图1B）（New England Biolabs，目录号：R0123S）

   b. 融合引物：
   VHH正向引物 5’ GTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCC 3’
   VHH反向引物 5’ GGTGATGGTGTTGGCCTTTATTAATGATGGTGGTGATGGTG 3’
   c. 校对聚合酶（例如，PhusionFlashTM高保真聚合酶，ThermoFisher Scientific，目录号：F548S）

   d. pADL-23c测序引物：PhDseqFwd 5’ GCTTCCGGCTCGTATGTTG 3’
   PhDseqRev 5’ GTCGTCTTTCCAGACGTTAG 3’
   e. 2 mL冷冻管（例如，ThermoFisher Scientific，目录号：5000-0020）

2. E. coli 表达

   a. WK6细胞 大肠杆菌 (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC，目录号：47078)

   b. Terrific肉汤培养基（见配方）

   c. 异丙基硫代-β-D-1-半乳糖苷，IPTG（Sigma-Aldrich，目录号：I6758）

   d. 葡萄糖

   e. 氯化镁

   f. 阿莫西林

3. VHH纯化

   a. TES缓冲液（见配方）

   b. 脱氧核糖核酸酶I（Sigma-Aldrich，目录号：D4263）

   c. 氯化镁（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）

   d. 蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389）

   
   图1. 载体图谱 (A) pOPINTTGneo (B) pADL-23c

C. VHH-RBD复合物的结晶

1. VHH-RBD复合物的制备

   a. EndoH (New England Biolabs，目录号：P0702S)

   b. SD200 10/300排阻色谱柱 (Cytiva，目录号：28990944)

2. 结晶筛选

   a. Swisssci Triple-Drop结晶板 (Molecular Dimensions，目录号：MD11-003-100)

   b. V型微孔板，无盖，自然色，聚丙烯 (Greiner，目录号：651201 96)

   c. VIEWsealTM板密封器，透明，不可穿透 (Greiner，目录号：676070)

   d. Pact premierTM结晶筛选条件 (Molecular Dimensions，目录号：MDSR-29)

   e. JCSG-plusTM结晶筛选条件 (Molecular Dimensions，目录号：MDSR-37)

   f. SG1TM结晶条件 (Molecular Dimensions，目录号：MDSR-88)

3. 晶体的冷冻保存

   a. 甘油 (Molecular Dimensions，目录号：MD2-100-65)

   b. PEG 400 (Sigma-Aldrich，目录号：06855)

   c. 已安装的圆形石版印刷环 (0.25 mm) (Molecular Dimensions，目录号：MD7-137)

   d. 已安装的圆形石版印刷环 (0.15 mm) (Molecular Dimensions，目录号：MD7-135)

   e. 标准泡沫杜瓦瓶 (Molecular Dimensions，目录号：MD7-35)

   f. Uni-Puck 10包装 (Molecular Dimensions，目录号：MD7-613)

   g. 冷冻工具套装 (Molecular Dimensions，目录号：MD7-517)

   h. 干燥运输器 (Molecular Dimensions，目录号：MD7-21

Equipment

1. Microvolume spectrophotometer (e.g., ThermoFisher Scientific, NanoDropTM One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer: ND-ONE-W)
2. CO2 orbital shaker (e.g., n-Biotek.com ANICELL incubator, catalog number: NB-206CXL/NB)
3. Tabletop centrifuge suitable for 50 mL Falcon tubes (Sorvall Legend RT Plus)
4. Cell Counter (e.g., ThermoFisher Scientific CountessTM 3 Automated Cell Counter)
5. ÄKTA Xpress automated multi-step purification system
6. Liquid handler (e.g., Hydra Dispenser by Art Robbins Instruments)
7. Low volume dispenser for crystallization plates (e.g., SPT labtech mosquito® LV)
8. Crystal plate imager (e.g., Formulatrix RockImager® system)

Procedure

A.受体结合域的生产

1. 载体构建

   a. 对于10 μL的融合反应，混合20 ng（1–3 μL）的合成基因，100 ng（1–2 μL）的PmeI/NcoI切割的pOPINTTG载体，1 μL的Exnase II，以及克隆试剂盒提供的优化缓冲液2 μL。

   b. 在37°C下孵育反应30分钟，然后立即加入20 μL的冰冷TE缓冲液以停止反应。

   c. 使用5 μL的反应混合物转化20 μL的Stellar感受态细胞，在冰上孵育30分钟，然后42°C下热击45秒。

   d. 加入400 μL的SOC培养基，并在37°C下孵育45分钟。

   e. 将细胞和培养基混合物中的100 μL涂布在含100 μg/mL阿莫西林的LB-琼脂平板上，并在37°C下过夜培养。

   f. 将单个菌落接种到含100 μg/mL阿莫西林的3 mL LB中，并在37°C下过夜培养。

   g. 通过向LB中的过夜培养细胞中加入0.5 mL的50%（v/v）无菌甘油，制备甘油储备液，并在-80°C下冷冻。

   h. 从沉淀的细胞中制备DNA，并使用pTTfwd和PTTrev引物通过DNA小量制备进行克隆确认。

   i. 使用50%的甘油储备液培养更大规模的培养物，用于制备转染级质粒。

   j. 从150 mL的过夜LB培养物中使用QIAGEN Plasmid Plus Midi试剂盒纯化转染级质粒（0.5–1 mg），如有必要，将质粒储存在-20°C的无菌1.5 mL Eppendorf管中。

   k. 使用NanoDrop分光光度计测量DNA的纯度和浓度。用于转染的质粒DNA应具有高纯度（见注释1）。

   l. 仪器会自动计算DNA的浓度和纯度，使用以下方程式：
   浓度：DNA (µg/mL) = (A260读数 - A320读数) × 稀释因子 × 50 µg/mL
   纯度：(A260/A280) = (A260读数 - A320读数) ÷ (A280读数 - A320读数)

   m. 每个转染的细胞使用1 μg的DNA。

2. 转染方法

   a. 在解冻后的至少三个传代（传代数3-30可用于实验）后，在湿度为80%，二氧化碳浓度为5-8%，温度为37°C的条件下，使用Gibco Expi293TM Express培养基在轨道摇床上以120 rpm的转速培养Expi293TM细胞悬浮培养，细胞密度在0.5至5.0 × 106细胞/mL之间。使用125 mL烧瓶维持30 mL的Expi293细胞。

   b. 转染前一天，将Expi293TM细胞播种在细胞密度为1 × 106细胞/mL的培养基中。对于每次RBD的准备，在500 mL烧瓶中设置三个170 mL的培养物。

   c. 转染当天，确定细胞计数和活力，如果细胞计数在2 × 106 - 2.5 × 106/mL之间且至少95%为活细胞，则进行转染（见注释2）。
   d. 对于每个170 mL的培养物，将17 mL的OPTI-MEM培养基与170 μg质粒DNA和918 μL的PEI Max 40kDa转染试剂混合在50 mL的Falcon管中。

   e. 充分混合，室温（RT）下孵育10分钟，然后轻轻（逐滴）加入Expi293TM细胞中（见注释3）。
   f. 从1 mg/mL的储备液中添加kifunensine（每100 mL培养体积100 μL），并将细胞放回轨道摇床上，以125 rpm的速度，5-8%的二氧化碳，80%的湿度和37°C的温度继续培养。

   g. 转染16-18小时后，向每个170 mL的培养物中添加2,890 μL的瓦罗酸、1,100 μL的丙酸钠和3,400 μL的葡萄糖。将培养物放回培养箱（见注释4）。

   h. 转染后第5天，确定细胞计数和活力。

   i. 收获培养基，并在6,000 × g的条件下在0.5 L离心管中离心20分钟。使用0.45 μm的0.5 L瓶顶过滤器进行过滤消毒。

3. 纯化

   IMAC-SEC纯化协议适用于ÄKTA Xpress平台，该协议在Nettleship等人（2009）中有描述。相同的工作流程也可以在其他具有自动峰检测的纯化系统中实现。Unicorn程序的转录本作为附录提供。

   a. 使用“Gel Filtration Equilibration”程序和Gel filtration缓冲液（20 mM Tris，pH 7.5，200 mM NaCl）平衡凝胶过滤柱。

   b. 按照“Mammalian Prepping System”方法设置系统。它将泵入洗涤A1和A2，并清洁进口。然后它会要求你将5-mL柱子拧入位置1，并将会平衡柱子。

   c. 将等体积的PBS加入到过滤的细胞上清中，并用NaOH将pH调至7.4。

   d. 一旦柱子插上电源且样品准备就绪，缓慢移除A2线上的缓冲液（通过小动作以避免管线中产生气泡），并将它插入样品中。确保所有管线都在瓶子的底部。

   e. 让程序在夜间运行。

   f. 使用ÄKTA的跟踪，选择包含目标蛋白的正确馏分。将10 μL的蛋白溶液与10 μL的样品缓冲液混合，并在95°C下加热5分钟。对样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，并用Instant Blue®染色。

   g. 使用10 kDa浓缩器在2,500 × g和4°C的条件下浓缩蛋白，通常浓缩至5 mg/mL。

   h. 分装（例如，0.1 mL）并在液氮中快速冷冻蛋白质，通过将试管浸入液氮中。

   i. 存放在-80°C。

B. Production of VHHs

1. 载体构建

   通过M13噬菌体展示库筛选确定的VHHs重新表达以生产蛋白质。

   a. 使用VHH Fwd引物和VHH Rev引物从源展示载体中扩增VHH，并使用以下PCR条件：
   \1) 98°C for 10 s
   \2) 30 cycles of:
   98°C for 1 s
   60°C for 5 s
   72°C for 15 s
   \3) 72°C for 2 min
   \4) 4°C hold

   b. 通过琼脂糖凝胶电泳纯化扩增的VHH DNA，并按照制造商的说明使用Nucleospin®试剂盒提取。将PCR产物克隆到SfiI切割的pADL-23c载体中，如RBD克隆所述。

   c. 通过使用PhDseqFwd和PhDseqRev引物进行测序验证克隆。

2. 在E. coli中的表达

   a. 按照上述描述，将RBD表达载体的构建转化到化学感受态WK6细胞中。

   b. 从转化细胞的平板上选取一个菌落，并设置预培养：8 mL TB培养基补充100 μg/mL阿莫西林、2%葡萄糖和1 mM MgCl2。

   c. 设置培养：2-L烧瓶中的800 mL TB培养基，补充100 μg/mL阿莫西林、0.1%葡萄糖和1 mM MgCl2。

   d. 预热烧瓶/培养基至37°C。

   e. 加入预培养物，并在轨道摇床上以225 rpm和37°C的生长速率培养。

   f. 当OD600达到约1.2时（通常需要约3.5小时），添加IPTG至最终浓度为1 mM，并在225 rpm和28°C的条件下继续培养过夜。

   g. 在4°C以2,500 × g的转速离心15分钟沉淀细胞。

3. VHH的纯化

   a. 将15 mL TES缓冲液添加到细胞沉淀中，并在4°C下用磁力搅拌器缓慢重悬过夜。

   b. 第二天，将两倍的体积的冷TES/4缓冲液（含120U Kunitz DNaseI）添加到重悬的培养物中，并缓慢搅拌2小时。

   c. 用TES/4缓冲液将体积补至80 mL。

   d. 在4°C以28,000 × g的转速离心30分钟（使用50 mL管）。

   e. 在真空条件下，通过0.8 μm过滤器过滤上清液。

   f. 用PBS（pH 7.4）将上清液稀释五倍，并充分混合。

   g. 将样品加载到两个串联的5-mL IMAC柱上，流速小于2 mL/min。

   h. 用含30 mM咪唑的PBS（pH 7.4）洗涤柱子。

   i. 用含300 mM咪唑的PBS以1 mL/min的速度洗脱样品，收集到96孔收集板中，每1 mL收集一个馏分。

   j. 合并A280峰值馏分（约7.5 mL）并在凝胶过滤缓冲液（50 mM Tris pH 7，150 mM NaCl）中通过Superose S75 16/600进行凝胶过滤。

   k. 合并A280峰值蛋白馏分，并使用5 kDa MWCO浓缩器浓缩，通常浓缩至15 mg/mL（见注释5）。

   l. 分装（例如，0.1 mL）并在液氮中快速冷冻蛋白质，通过将试管浸入液氮中。

   m. 存放在-80°C。

C. VHH-RBD复合物的结晶

1. VHH:RBD复合物的制备

   a. 在冷室中，以2 rpm的转速搅拌下，将5 mg RBD（5 mg/mL）与3 mg VHH（15 mg/mL）按RBD:VHH的摩尔比为1:1.2混合，并在冷室中孵化3小时（见注释6）。

   b. 在室温下，以2 rpm的转速搅拌下，将RBD-VHH复合物与0.4 mg EndoH糖苷酶（1 mg/mL）孵化过夜（见注释7）。

   c. 使用5 kDa MWCO浓缩器将混合物浓缩至1 mL，并注入到凝胶过滤缓冲液（50 mM Tris pH 7，150 mM NaCl）中的Superose 200 10/300柱上。

   d. 监测A280，收集峰值馏分，并使用5 kDa MWCO浓缩器浓缩至20 mg/mL（见图2和3）。

2. 
   图2. 在SD200 20/300排阻色谱柱上纯化VHH-RBD复合物（CV 23.56 mL)。

   
   图3. SDS-PAGE分析RBD（泳道1）、VHH（泳道2）以及RBD-VHH复合物经EndoH处理后的凝胶过滤馏分（泳道3-12)。

3. 结晶筛选

   1. 使用Hydra液体处理器，将25 μL的结晶溶液从96孔主块中分配到Swisssci结晶板的底座孔中。
   2. 使用移液器将蛋白质溶液滴入V型微孔板孔中的柱中。
   3. 使用机器人液体处理器（Mosquito）设置一个由288滴组成的坐滴板，使用三种蛋白质：底座比例（100 nL蛋白质 + 100 nL底座；200 nL蛋白质 + 100 nL底座；100 nL蛋白质 + 200 nL底座）（见注释8）。
   4. 使用VIEWseal密封完成的板。
   5. 在Formulatrix成像器中，按照Fibonacci时间表以20°C的温度拍摄和存储板（见图4中晶体示例）。
   6. 剪去密封膜上的一个方块，打开滴。
   7. 将1 μL的冷冻保护剂混合物（原始结晶条件中的30%甘油或Peg 400）滴在晶体/滴上。表1提供了结晶化VHH-RBD复合物的示例。
   8. 将磁性棒上的安装针放在磁性棒上，从滴中钩住晶体，并迅速放入含有液氮的泡沫杜瓦瓶中。
   9. 将装有晶体的圆柱放入泡沫杜瓦瓶中。
   10. 将圆柱转移到预冷的干式运输器中。

   表1. 结晶化VHH-RBD复合物的示例，包括结晶条件的详细信息、空间群和晶体产生的分辨率极限。

   Complex	RBD-F2	RBD-H3-C1	RBD-C5
   Crystal screen	PactTM	JCSGTM	SG1TM
   Crystallisation condition	0.1 M SPG, pH 8, 25% Peg 1500	1.0 M Lithium chloride, 0.1 M Citrate pH 4, 20% Peg 6000	0.2 M Na Acetate, 0.1 M Na Cacodylate pH 6.5 and 30% w/v PEG 8000
   Time for crystal formation	3 days	less than 24 h	3 days optimal growth
   Ratio	0.2 μL protein with 0.1 μL reservoir	0.2 μL protein with 0.1 μL reservoir	0.1 μL protein with 0.1 μL reservoir
   Concentration	34 mg/mL	18 mg/mL	18 mg/mL
   Cryoprotectant	glycerol	Peg400	glycerol
   Data collection
   Exposure	0.006s	0.012s	0.008s
   Space group	P31	P41212	P21212
   Resolution (Å)	2.3	1.9	1.5

图4. 不同复合物的晶体形状：RBD-F2（左），RBD-H3-C1（中）和RBD-C5（右)。

注：

1. 高质量的DNA应具有最低限度的蛋白质和化学污染，其吸收比260/280应在1.8-2.0之间，260/230应在2.0-2.2之间。
2. 我们的协议适用于任何规模的表达：1-3 mL板实验，以及30-300 mL的扩大表达在烧瓶中。提供的体积和试剂量应与转染细胞的体积成比例。
3. 不要直接混合DNA和PEI，因为它们会立即沉淀。
4. 瓦罗酸、丙酸钠（组蛋白去乙酰化酶抑制剂）和葡萄糖的组合使用可以显著提高基因表达。
5. 在浓缩步骤中，检查是否有VHH沉淀非常重要，如果观察到沉淀，应停止进一步浓缩蛋白质。任何沉淀物都可以通过在微旋离心机中以12,000 × g的速度离心10分钟来去除，然后通过在280 nm处的吸光度来测量最终蛋白质浓度。
6. 添加过量的VHH，以确保RBD与纳米体完全复合。
7. EndoH在pH ~5.2时效率最高。然而，由于大多数蛋白质在这个pH下不稳定，反应在pH 7.5下进行。此外，许多蛋白质长时间在37°C下不稳定，因此室温是反应的首选。EndoH在室温和pH 7.5下活跃，但在最佳条件下反应时间会更长。
8. 两种稀疏矩阵筛选（JCSG+和SG1）通常以两种不同浓度（通常是34 mg/mL和18 mg/mL）进行筛选，比例为三种。对于复合物RBD-F2和RBD-H3-C1，我们得到了许多结晶命中，而对于RBD-C5，我们只得到了一个命中。偶尔使用PACT筛选。从稀疏矩阵筛选中收获的晶体不需要进一步优化。为了获得更多不同衍射质量的晶体，通常在蚊子上设置相同的条件作为一行，使用相同的协议。这还允许测试两种不同的冷冻条件（通常是甘油和Peg 400）。晶体非常可重复。通常在生长后24小时内收获所有命中中的最清晰的晶体，但大多数命中在随后5天内衍射质量保持稳定。

配方

1. 瓦罗酸
   将500 mg的瓦罗酸溶解在10 mL的细胞培养基或HBSS中，过滤0.2 μm，并储存在-20°C。

2. 丙酸钠溶液
   将1 g的丙酸钠溶解在10 mL的细胞培养基或HBSS中，过滤，并储存在-20°C。

3. PEI
   将100 mg的PEI Max 40K悬浮在90 mL的MilliQ水中。使用PTFE涂层的搅拌棒搅拌。溶解时间应少于5分钟，然后使用NaOH或HCl将pH调整至7.0。加水上至100 mL，过滤0.2 μm，并储存在-20°C。

4. 葡萄糖
   将45 g的葡萄糖溶解在100 mL的HBSS或细胞培养基中，过滤0.2 μm，并储存在-20°C。

5. 洗涤缓冲液
   PBS + 30 mM咪唑 pH 7.4

6. 洗脱缓冲液
   PBS + 300 mM咪唑 pH 7.4

7. 凝胶过滤缓冲液
   20 mM Tris，pH 7.5，200 mM NaCl，或50 mM Tris pH 7，150 mM NaCl

8. TES缓冲液
   200 mM Tris pH 8，0.5 mM EDTA，500 mM蔗糖

9. TES/4缓冲液
   50 mM Tris pH 8，125 mM蔗糖

10. TB培养基
    酵母提取物（24 g/L），胰蛋白胨（20 g/L），甘油（4 mL/L），磷酸盐缓冲液（100 mL/L）为0.17 M KH2PO4，0.72 M K2HPO4

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