小鼠ESC分化成Nkx2.1+肺和甲状腺祖细胞

2024-03-08

字数统计: 2.5k字 | 阅读时长≈ 10分

来源：TL Tyler A. Longmire LI Laertis Ikonomou Darrell N. Kotton email

第一次发布: 2012年11月20日第2卷第22期 DOI: 10.21769/BioProtoc.295

简介

来自多能干细胞的肺祖细胞的新发现提供了在体外模拟早期肺发育的机会，并且容易获得用于组织工程或基础细胞生物学研究的细胞。该详细方案允许从小鼠胚胎干细胞（ESC）或诱导多能干细胞（iPSC）系生成肺和甲状腺祖细胞。当与公布的Nkx2.1-GFP敲入ESC系一起使用时，该方案允许通过基于对最早已知的肺和甲状腺细胞命运的标记物的诱导在GFP报告基因上进行分选来跟踪和纯化肺和甲状腺祖细胞， Nkx2.1。在分选后，然后可以在无血清条件下培养纯化的Nkx2.1 +细胞群，以进一步扩增，分化和成熟。

材料和试剂

携带敲入Nkx2.1基因座（Nkx2.1-GFP ESC）的GFP报告基因的小鼠ESC或iPSC（Longmire等人，2012）
1x 0.05％胰蛋白酶-EDTA（Life Technologies，Gibco ，目录号：25300-054）
定制的胎牛血清（Hyclone，目录号：SH30070.03）
IMDM粉末（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：12200-036）
NaHCO3（Sigma-Aldrich，目录号：S-5761）
Pen/Strep（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：15140-148）（10,000U青霉素和10mg链霉素/ml）
Cellgro水（VWR，目录号：45000-672）
Ham’s F-12（Cellgro，目录号：10-080-CV）
B-27补充RA（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：17504-044）
N-2补充剂（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：17502-048）
BSA中的7.5％BSA（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：15260-037）
1-硫代甘油（MTG）（Sigma，M6145-25ml）
200mM L-谷氨酰胺（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：25030-081）
抗坏血酸（Sigma-Aldrich，目录号：A4544-25G）
1M HEPES（Gibco，15630-080）
CaCl2（Sigma-Aldrich，目录号：C4901）
BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A9418-10G）
100x ITS补充剂（BD Biosciences，目录号：354352）
mNoggin（R& D Systems，目录号：1967-NG-025）
SB431542（Sigma-Aldrich，目录号：S4317）
mRnt3a（R& D Systems，目录号：1324-WN-010）
hBMP4（R& D Systems，目录号：314-BP-050）
hEGF（R& D Systems，目录号：236-EG-01M）
mFGF2（R& D Systems，目录号：目录号：3139-FB-025）
mFGF7（R& D Systems，目录号：5028-KG-025）
hFGF10（R& D Systems，目录号：345-FG-025）
肝素钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：H4784-250mg）
地塞米松（Sigma-Aldrich，目录号：D4902）
8-Br-cAMP（Sigma-Aldrich，目录号：B7880）
IBMX（Sigma-Aldrich，目录号：I5879）
DMSO，Hybri-Max（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
激活素A（R& D Systems，目录号：338-AC）
PBS（Life Technologies，Gibco ，目录号：14190-250）
0.1％明胶在超纯水（EMD Millipore，目录号：ES-006-B）中
Cxcr4抗体：APC大鼠抗小鼠CD184（Cxcr4）（BD-Pharmigen，目录号：558644）
cKit抗体：PE大鼠抗小鼠CD117（cKit）（BD-Pharmigen，目录号：553355）
APC同种型：APC大鼠IgG 2b，κ（BD-Pharmigen，目录号：553991）
PE同种型：PE大鼠IgG 2b，κ（BD-Pharmigen，目录号：553989）
IMDM（请参阅配方）
无血清分化培养基（SFD）（参见配方）
完全无血清分化培养基（cSFDM）（参见配方）
DCI + K的BASE介质（参见配方）
前置介质（参见配方）
中和介质（见配方）
DCI + K介质（见配方）
制备10x cAMP + IBMX储液（见配方）

设备和器具

P100培养皿（100mm×15mm细菌培养皿，未处理的聚苯乙烯，BD Falcon ，目录号：351029）
P150培养皿（150mm×15mm细菌培养皿，未处理的聚苯乙烯，BD Falcon ，目录号：351058）
12×75mm，具有细胞过滤帽（BD，352235）的5ml聚苯乙烯圆底试管
1.5-ml Eppendorf Snap-Cap微量离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：05-402-25）
离心机
LSRII 流式细胞仪
0.22μm过滤器

步骤

工作时间线
1. 时间点：0小时
  1. Nkx2-1-GFP小鼠ESC或iPSC在2i_LIF（无血清，无饲养细胞）条件下培养。对于每个实验，将第23个通道的新小瓶解冻，并在两次传代后使用细胞
  2. 每个具有12.5ml /皿cSFDM的P100培养皿种子500,000Nkx2-1-GFP小鼠ESC或iPSC（悬浮液）。
  3. 在此期间，ESC或iPSC将形成100-300μm之间的将保持悬浮的胚状体（EB）。
2. 时间点：60小时
  1. 从一个盘中收集EB在一个50毫升锥形，让EB定居1-2分钟，小心删除大部分含有死细胞和碎片的上清液。
  2. 旋转5分钟，300×g <4℃，4℃
  3. 吸出上清液。
  4. 每管加入1ml 0.05％胰蛋白酶/EDTA，在37℃水浴中孵育1分钟，同时涡旋管。
  5. 通过温和研磨分解EB以形成单细胞悬浮液
  6. 加入1ml血清封闭胰蛋白酶
  7. 加入4ml IMDM。
  8. 旋转5分钟，300×g <4℃，4℃
  9. 将细胞重悬于5ml cSFDM中
  10. 计数单元格。
  11. 在每个P100或P150培养皿中，在补充有50ng/ml激活素A的25ml cSFDM中平板0.5-1×10 6个细胞（悬浮液），用于定形内胚层诱导和EB形成。
3. 时间点：120小时（第5天）
  1. 对替代定形内胚层标记物（Cxcr4/cKit，参见FACS方案）进行染色以证实有效的定形内胚层诱导（超过40-50％的细胞应该是Cxcr4 + sup/cKit sup>）。
  2. 收集EB并在IMDM中清洗。
  3. 旋转5分钟，300×g <4℃，4℃
  4. 重悬在10-15毫升前化培养基和板悬浮在新的P100培养皿
4. 时间点：144小时（第6天）
  1. 收集EB。
  2. 在IMDM中清洗。
  3. 旋转5分钟，300×g <4℃，4℃
  4. 通过胰蛋白酶消化1ml等份的EB以获得单个细胞并计算总细胞数当量来获得细胞计数。
  5. 重悬在腹侧培养基中
  6. 在明胶包被的平板或皿（例如24孔板的100,000 /孔）上涂布50,000个细胞/cm 2的EB当量。涂层程序参见下面的步骤2
  7. 每隔一天更换一次媒体。
  8. GFP + 将在第8-9天开始出现
5. 时间点：第15天
  1. 取出腹腔介质并加入适当体积的胰蛋白酶（例如，每孔6ml板1ml/P100皿3-4ml）。
  2. 转移细胞从50毫升锥形的几个井，通过温和研磨形成单细胞悬浮液，并与等体积的FBS灭活。
  3. 重悬于PBS + （PBS + 2％FBS）中
  4. 排序GFP + cells。
  5. 旋转7分钟，500 x g ，4°C（注意离心机设置的变化）。
  6. 在补充有FGF2（250ng/ml），FGF10（100ng/ml）的cSFDM中复制25,000个细胞/cm 2（例如，24-孔板的50,000个细胞/ml）和肝素盐（100ng/ml）
  7. 每隔7天更换一次媒体。
6. 时间点：第22天
  1. 取出介质并用PBS冲洗。
  2. 切换到DCI + K媒体
  3. 在第25天收获细胞（程序与第15天相同）
明胶涂层
在室温下（例如在6孔板的孔中1ml）施加0.1％明胶（溶解在超纯水中）25-30分钟。吸出明胶，用PBS冲洗，并再次吸出。该板现在可以使用了。
Cxcr4/cKit的FACS
1. 细胞计数
  1. 取出1毫升EB，旋转和胰蛋白酶消化（0.5毫升胰蛋白酶），计数细胞
  2. 根据以前的细胞计数，去除对应于2-2.5×10 6 细胞的培养体积。
  3. 对未分化ES细胞重复步骤。
2. 制备用于染色的细胞（在冰上的所有步骤）
  1. 离心EB，重悬在1ml胰蛋白酶（60秒在37℃），用P1000移液管单分散。
  2. 用1ml血清灭活，离心（5分钟，300×g，4℃），并用5ml IMDM洗涤一次。
  3. 重悬于500μlPBS中（PBS + 2％FBS），细胞浓度应为0.4-0.5×10 6细胞/100μl。
  4. 准备2×5 Eppendorf管（未染色，同种型，Cxcr4，cKit，Cxcr4/cKit（双）），标记每个管系列（D5内胚层或未分化的ES细胞），并将100μl每种培养物转移到每个管。
3. 细胞染色
  1. 每管加入合适的抗体（例如，在”未染色”管中没有抗体，”双”管中的两种抗体）。
    用于此协议的抗体为08/15/12：
    同种型：APC大鼠IgG 2b，κ
    同种型：PE大鼠IgC 2b，κ
    Cxcr4：APC大鼠α - 小鼠CD184
    cKit：PE鼠α小鼠CD117
  2. 短暂涡旋并在冰上转移30分钟（用铝箔覆盖，在15分钟再次涡旋）
  3. 每个管中加入1ml PBS ，在台式离心机中以300×g旋转5分钟，小心地吸出上清液。
  4. 在500μlPBS +中重悬沉淀。
  5. 转移到带有细胞过滤器帽的FACS聚苯乙烯管
  6. 将细胞送到LSRII进行分析。

试剂

IMDM
1包IMDM粉末
3.02g NaHCO 3/v/v 10ml Pen/Strep
1 L Cellgro水
检查pH（可接受范围6.9≤pH≤7.3）
无血清分化培养基（SFD）
IMDM-375 ml
火腿的F-1-125毫升
B-27补充RA-5 ml
N-2补充-2.5毫升
BSA 7.5％的PBS-3.3ml
完全无血清分化培养基（cSFDM）
SFD -100 ml
MTG300μl储备液（库存：26μlMTG至2ml IMDM）
200 mM L-Glut -1 ml
抗坏血酸-1ml原液（库存：5mg/ml蒸馏水，新鲜制备）
DCI + K的BASE介质
Ham’s F-12-243.7 ml
1.0 M HEPES（pH 7.4）-3.75 ml
1.0M CaCl 2-200μl
BSA-0.625g
100x ITS补充-2.5毫升
前置媒介
cSFDM-10 ml
mNoggin-100ng ml（储备：10μg/ml） SB431542-10μM（储备液：10mM，在DMSO中）
中和介质
cSFDM - 10ml
mWnt3a-100ng/ml（储备：100μg/ml） hBMP4-10ng/ml （储备：10μg/ml） hEGF-20ng/ml（储备：20μg/ml） mFGF2-250ng/ml（储备：100μg/ml） mFGF7-10ng/ml（储备：10μg/ml） hFGF10-10ng/ml（储备：10μg/ml）肝素钠盐-100ng/ml血浆（储备液：1mg/ml）
DCI + K介质
BASE培养基 - 25 ml
地塞米松-50nM（储备液：250μM，在乙醇中）
KGF（FGF7）-10ng/ml（储备：10μg/ml） cAMP + IBMX-0.1mM（储备液：1mM cAMP + 1mM IBMX）
制备10x cAMP + IBMX公司
将22.22mg IBMX溶于1ml DMSO（0.1M IBMX储备液，-20℃储存）中
为了制备1mM cAMP + 1mM IBMX（10x）原液，将21.5mg 8BrcAMP溶解在49.5ml BASE培养基中，并加入0.5ml IBMX贮液器
0.22μm过滤器
在4°C下存储最多4周

References

Gonzales, L. W., Guttentag, S. H., Wade, K. C., Postle, A. D. and Ballard, P. L. (2002). Differentiation of human pulmonary type II cells in vitro by glucocorticoid plus cAMP. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 283(5): L940 - 951.
Longmire, T. A., Ikonomou, L., Hawkins, F., Christodoulou, C., Cao, Y., Jean, J. C., Kwok, L. W., Mou, H., Rajagopal, J., Shen, S. S., Dowton, A. A., Serra, M., Weiss, D. J., Green, M. D., Snoeck, H. W., Ramirez, M. I. and Kotton, D. N. (2012). Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells. Cell Stem Cell 10(4): 398-411.
Wray, J., Kalkan, T., and Smith, A.G. (2010). Revolutionizing Drug Discovery with Stem Cell Technology. Biochem Soc Trans 38, 1027-1032.

本文作者： Anderson
本文链接： http://nikolahuang.github.io/2024/03/08/小鼠ESC分化成Nkx2-1-肺和甲状腺祖细胞/
版权声明： 转载请注明出处，谢谢。

简介

材料和试剂

设备和器具

步骤

工作时间线

时间点：0小时

时间点：60小时

时间点：120小时（第5天）

时间点：144小时（第6天）

时间点：第15天

时间点：第22天

明胶涂层

Cxcr4/cKit的FACS

细胞计数

制备用于染色的细胞（在冰上的所有步骤）

细胞染色

试剂

IMDM

无血清分化培养基（SFD）

完全无血清分化培养基（cSFDM）

DCI + K的BASE介质

前置媒介

中和介质

DCI + K介质

制备10x cAMP + IBMX公司

References